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深度解讀

MMI激光顯微切割系統(tǒng)捕獲共生有化學細菌的海綿細胞

來源:基因有限公司2020-05-14 我要評論(0 )   

今天要和大家分享的主題是由普林斯頓大學分子生物學系Tianero, M.D.等研究人員發(fā)表在Nature Microbiology的“Localized production of defence chemicals by intracellu...

今天要和大家分享的主題是由普林斯頓大學分子生物學系Tianero, M.D.等研究人員發(fā)表在Nature Microbiology的“Localized production of defence chemicals by intracellular symbionts of Haliclona sponges”文章。作者通過MMI CellCut PLus激光顯微切割技術(shù)、二代測序技術(shù)、流式分選技術(shù)及FISH技術(shù)等做了一個有趣的研究,在含有renieramycin生物堿的海綿Haliclona sp.中發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生renieramycin生物堿的共生菌Candidatus Endohaliclona renieramycinifaciens(Ca. E.?renieramycinifaciens)。值得注意的是,共生菌Ca. E.?renieramycinifaciens已經(jīng)經(jīng)歷了極端的基因組減少,它幾乎失去了自由生活所需的所有元素,同時保持了一個復雜的、質(zhì)粒編碼的多拷貝renieramycin生物堿生物合成基因簇。共生菌Ca. E.?renieramycinifaciens存在于海綿以前未經(jīng)鑒定的細胞庫(化學細菌細胞)中,它產(chǎn)生的renieramycin生物堿為宿主提供一種抵御捕食和微生物感染的化學防御手段。這種共生關(guān)系在Haliclona海綿的一個分支中具有高度的特異性。
 
海洋海綿是微生物多樣性最豐富的后生動物宿主之一。它們被認為是最原始的生物,是研究微生物與宿主相互作用的良好模型系統(tǒng)。海綿中的共生菌會產(chǎn)生許多具有不同生物活性的復雜代謝產(chǎn)物,其中包括未被充分研究的海綿代謝產(chǎn)物renieramycin生物堿。迄今為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了約30種renieramycin生物堿,它們發(fā)揮了廣泛的抗微生物和細胞毒性活性,這些活性在生態(tài)和治療上都具有重要意義。從生物合成的角度來看,對renieramycin生物堿的了解還很少。renieramycin生物堿核心結(jié)構(gòu)類似于四氫呋喃類的黃霉素,由于其組分較為廣泛,引發(fā)了作者的研究興趣,想確定最原始的后生動物:海洋海綿中的renieramycin生物堿生產(chǎn)的來源和分子基礎。

首先,作者收集了四種來自不同太平洋地區(qū)不同年份和地理位置的含renieramycin生物堿的Haliclona海綿樣品:Ren-Pal-02(帕勞,2002年),Ren-PNG-07060,RenPNG-07113(巴布亞新幾內(nèi)亞,2007)和Ren-Bali-16-03(巴厘島,2016)。通過高效液相色譜結(jié)合高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-HR-MS / MS)和核磁共振(NMR)化學分析驗證了這些海綿中確實存在renieramycin生物堿。然后通過18S rRNA測序,確定了4種海綿具有較高的同源性(99.9%)。隨后通過對4種海綿進行宏基因組測序分析,發(fā)現(xiàn)在海綿微生物中存在renieramycin生物堿生物合成基因簇(BGC),并進一步通過驗證了ren(renieramycin生物堿生物合成基因簇,renieramycin BGCs)參與renieramycin的生物合成。

在發(fā)現(xiàn)了具有明顯細菌起源的ren之后,作者試圖進一步找出其基因組中含有ren的微生物組的成員,且該成員負責renieramycin生物堿的生產(chǎn)。通過對宏基因組的分析,發(fā)現(xiàn)ren存在于所有四個樣品基因組中的一個小的細菌質(zhì)粒上:p-ren。通過對宏基因組的分析發(fā)現(xiàn)有一個細菌染色體在序列保守性水平、覆蓋率和GC含量上與p-ren相似,并把這種細菌命名為Ca. E.?renieramycinifaciens。通過流式分選海綿勻漿的細胞,將細胞分類為不同大小的細胞(P3-P10),分別提取DNA進行16s rRNA測序,并對P4和P7到P10進行宏基因組測序。對測序結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)Ca. E.?renieramycinifaciens和p-ren主要富集在比較大顆粒的細胞中,且在五個分區(qū)的基因組中,Ca. E.?renieramycinifaciens染色體和p-ren呈強正相關(guān)。進一步通過熒光原位雜交(FISH)和顯微鏡成像證明了Ca. E.?renieramycinifaciens是一種細胞內(nèi)共生體,僅存在于大型海綿細菌細胞(sponge bacteriocyte)中。



盡管流式細胞術(shù)、細胞分類和宏基因組結(jié)合分析為p-ren與Ca. E.?renieramycinifaciens染色體的共域化提供了有力的支持,并且從顯微鏡下發(fā)現(xiàn)Ca. E.?renieramycinifaciens存在于特殊的海綿細菌細胞中,但還不足以說明Ca. E.?renieramycinifaciens中帶有p-ren。因此作者試圖進行最后一個實驗,確定p-ren到Ca. E.?renieramycinifaciens的位置。


借助易于識別的大海綿細菌細胞的球形形狀,使用MMI CellCut PLus激光捕獲顯微切割(LCM)從稀釋的Ren-Bali-16-03海綿勻漿中分離出100個此類單細胞。然后,從捕獲的細胞中提取并測序了DNA,并與從捕獲的背景膜中分離出的DNA作為對照進行了比較,分析了它們的宏基因組。結(jié)果明確表明Ca. E.?renieramycinifaciens帶有p-ren,并將renieramycin生物堿的產(chǎn)生進一步局限在海綿狀細菌細胞中。因此,作者提出術(shù)語“化學細菌細胞”來描述海綿細胞,在該海綿細胞中,細胞內(nèi)細菌共生體會產(chǎn)生化學防御分子。

最后,作者還根據(jù)16S rRNA基因及宏基因組數(shù)據(jù)的分析,證明了Ca. E.?renieramycinifaciens基因組極度減少,為不能自由生活的專性長期共生體。利用高通量16S rRNA基因測序數(shù)據(jù)和18S rRNA基因序列構(gòu)建的宿主海綿的系統(tǒng)樹比較了不同的海綿,證實了Ca. E.?renieramycinifaciens是一種特異性的海生海綿分支的細胞內(nèi)共生體,在那里它控制著生物群落,專門生產(chǎn)renieramycin生物堿。


通過作者的研究,可以深刻了解到海綿將重要的結(jié)構(gòu)和防御作用外包給了在其化學細菌細胞內(nèi)共生的特殊化學細菌Ca. E.?renieramycinifaciens。這個例子發(fā)生在最古老的后生動物身上,代表了微生物與宿主相互作用的祖先觀點,并強調(diào)了在海綿體中發(fā)現(xiàn)更多細胞內(nèi)共生體的重要性。


參考文獻
Tianero, M.D., Balaich, J.N. & Donia, M.S. Localized production of defence chemicals by intracellular symbionts of Haliclona sponges. Nat Microbiol 4, 1149–1159 (2019). https://doi.org/10.1038/s41564-019-0415-8

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